Koleksi
Beberapa lokomotif uap yang ada di sini adalah 2 unit kelas B25 (Esslingen 0-4-2RT) yaitu B2502 dan B2503. Keduanya adalah unit lokomotif yang tersisa. Lokomotif ketiga, B2501, dimonumenkan di Monumen Palagan Ambarawa.[17] Dahulu, terdapat loko uap kelas E10 (Esslingen 0-10-0RT), bernomor E1060 yang semula dikirimkan ke Sumatera Barat pada tahun 1960 untuk menarik kereta api batu bara, kemudian dibawa ke Jawa. Lalu, sebuah lokomotif konvensional 2-6-0T C1218 dihidupkan kembali pada tahun 2006 setelah lama disimpan di Cepu dan direlokasi ke Ambarawa tahun 2002. Namun, lokomotif E1060 dipulangkan kembali ke Sawahlunto, sedangkan lokomotif C1218 dibawa ke Surakarta dijadikan kereta wisata Jaladara.[18] Baru-baru ini, museum mendapat tambahan lokomotif diesel hidraulis D 300 23. Lokomotif ini berasal dari depo lokomotif Cepu yang dipindah ke depo lokomotif Ambarawa pada 6 Oktober 2010.[19] Lokomotif uap B 5112, buatan pabrik Hanomag, telah berhasil dihidupkan kembali sejak Januari 2014.[20]
Museum Ambarawa juga mempunyai beberapa koleksi baru seperti kereta inspeksi Sultan Madura, kereta kayu dari Kebonpolo, Magelang, NR kayu dari Balai Yasa Yogyakarta, gerbong GR dari Balai Yasa Manggarai, serta lokomotif diesel CC 200 15 dan lokomotif DD5512, yang dahulu berbasis di Stasiun Cirebon dan Stasiun Jatibarang.[21][22] Ada pula satu unit lokomotif BB200.[23] Lokomotif-lokomotif diesel tersebut sebagian telah dipindah ke Stasiun Tuntang.
Koleksi lain adalah halte Cicayur dan Cikoya, beberapa halte kayu di jalur kereta api Purwosari–Wonogiri, persinyalan mekanik, pencetakan tiket, peralatan administrasi, serta atribut perusahaan dari era SS dan NIS hingga PJKA.
Pada November 2024, Lokomotif D301 44 yang merupakan lokomotif langsir Balai yasa Yogyakarta dipindahkan ke museum kereta api Ambarawa sebagai penarik kereta wisata Ambarawa-Tuntang. Lokomotif tersebut didatangkan setelah lokomotif uap yang digunakan sebagai penarik kereta wisata Ambarawa-Tuntang mengalami kerusakan dan tidak dilakukan perbaikan. Sebagai gantinya, Balai yasa Yogyakarta mendatangkan lokomotif BB300 24 dari Balai yasa Tegal.
Banyak koleksi lokomotif maupun kereta di Museum Kereta Api Ambarawa berada dalam kondisi yang memprihatinkan akibat minimnya perawatan. Sejumlah lokomotif uap menunjukkan tanda-tanda korosi yang cukup signifikan, sehingga mengurangi nilai estetika dan historis.[24]