Penelope Puff adalah sebuah karakter fiksi dalam serial televisi animasiSpongeBob SquarePants dan dua film yang berdasarkan pada waralaba tersebut. Ia diisi suaranya oleh aktris Mary Jo Catlett dan melakukan debut dalam episode musim satu "Boating School" pada 7 Agustus 1999. Nyonya Puff dibuat dan dirancang oleh pakar biologi laut dan animator Stephen Hillenburg. Ia mengembangkan karakter tersebut dalam menanggapi permintaan dari Nickelodeon agar acara tersebut menampilkan guru sekolah. Hillenburg tak ingin menulis SpongeBob SquarePants sebagai anak usia sekolah, sehingga Nyonya Puff diperkenalkan sebagai guru mengemudi ketimbang guru sekolah dasar.
